一九零三年，摩尔根被聘任为哥伦比亚大学实验动物学教授，开始进化和遗传方面的研究工作，他对孟德尔豌豆实验得出遗传因子分离定律、自由组合定律将信将疑，想通过动物实验进行证实。
因为之前摩尔根从事胚胎学研究，对老鼠比较熟悉，实验前几年，他和学生使用家鼠和野鼠杂交进行实验研究，可能是老鼠繁殖周期太长，繁殖效率太低，实验进行几年没有取得进展。
一九零八年，摩尔根开始使用果蝇作为实验材料。
果蝇饲养容易，一点点香蕉浆就可以当它们一天的口粮；果蝇繁殖力强，条件适宜的情况下，一天时间卵即可孵化出幼虫，两三天变成蛹，再过五天变为成虫，一年可以繁殖三十代以上；果蝇体形小，一只牛奶瓶就可以饲养几十只。
想要研究遗传，必须让实验动物有可以区分的特征，这些特征只能通过变异获得，经过两年漫长的实验，摩尔根终于获得一只变异的白眼雄果蝇，以前的培育出的果蝇都是红眼，白眼是第一次出现。
摩尔根激动万分，将这只宝贝果蝇放在单独的瓶子中饲养。每天晚上，摩尔根带着这只果蝇回家，睡觉时将实验瓶放在身边，白天又带着它去上班，生怕它出现意外情况。
在他的精心照料下，原本虚弱的白眼果蝇终于在与一只红眼雌性果蝇交配后才寿终正寝，将突变的基因留给了下一代果蝇，留给了苦心栽培它的摩尔根。
这只白眼雄果蝇的后代，十天后长大为果蝇成虫，全部都是红眼。
根据孟德尔的遗传理论推断，红眼是显性基因，白眼是隐性基因，只有只有染色体上对应的两个基因都是白眼基因，果蝇才会显现出白眼特征。
他用这些变异白眼雄果蝇基因的后代互相交配，产生第二代杂交果蝇。焦急地等待了十天，摩尔根得到了第二代杂交果蝇，其中有三千四百七十个红眼果蝇，七百八十二个白眼果蝇，大致符合四分之一的比例，证实了孟德尔的遗传定律。
后来，他让一只白眼雌果蝇与一只正常的雄果蝇交配，却在其后代中得到雄果蝇全部是白眼，而雌果蝇中却没有白眼，全部雌性都长有正常的红眼睛。
由此摩尔根提出一种假说，果蝇眼睛的颜色基因与性别决定的基因是结合在一起的，即在x染色体上，或者就是两种基因有某种连锁效应，假如一条带有白眼基因的x染色体，又有一条有白眼基因的y染色体，即发育为白眼雄果蝇。
后续他们又观察到果蝇多次变异特征，进行遗传学实验，都表现出相同的规律。
根据一系列的实验结论，一九一一年，摩尔根提出了“染色体遗传理论”。
摩尔根发现，代表生物遗传秘密的基因的确存在于生殖细胞的染色体上，并且，基因在每条染色体上是直线排列的。到一九二五年的时候，摩尔根已经发现果蝇有四对染色体，并鉴定出约一百个不同的基因。
染色体可以自由组合，而排在一条染色体上的基因是不能自由组合的。摩尔根把这种特点称为基因的“连锁”。
他在长期的试验中发现，由于同源染色体的断离与结合，而产生了基因的自由组合。不过这种基因交换的情况很少，只占百分之一。
基因的连锁和互换是生物界的普遍现象，也是造成生物多样性的重要原因之一。
基因的连锁和交换定律，是摩尔根发现的遗传第三定律。
这条定律是摩尔根在遗传学领域的一大贡献，与孟德尔提出的基因分离定律、自由组合定律一道，被称为遗传学三大定律。
摩尔根由此创立了着名的基因学说，揭示了基因是组成染色体的遗传单位，它能控制遗传性状的发育，也是突变、重组、交换的基本单位。继孟德尔的豌豆实验后，摩尔根的果蝇实验，将生物遗传学研究又向前推进了一大步。